Masson染色是一种用于显示组织中纤维成分的特殊染色方法，主要用于区分胶原纤维和肌纤维，在病理学和组织学研究中有广泛的应用。 **一、染色原理** 1. 试剂作用    - **酸性复红**：它是一种酸性染料，能够将细胞质、肌纤维等染成红色。在染色过程中，酸性复红与肌纤维中的碱性蛋白结合，使肌纤维呈现出红色。    - **磷钼酸和磷钨酸**：这两种试剂起到分化的作用。它们可以使已染上酸性复红的肌纤维颜色更加鲜明，同时可以去除细胞质中多余的红色染料，使背景更加清晰。    - **苯胺蓝**：是一种碱性染料，主要用于染胶原纤维。胶原纤维在酸性环境下带有正电荷，而苯胺蓝带有负电荷，两者结合后使胶原纤维染成蓝色。 **二、实验材料和设备** 1. 材料    - **组织样本**：通常为石蜡切片或冰冻切片。石蜡切片需要经过固定、脱水、透明、浸蜡等处理；冰冻切片是将组织快速冷冻后切片，能较好地保存组织中的抗原成分，但组织结构可能不如石蜡切片清晰。    - **染色试剂**：Masson染色试剂盒，一般包含酸性复红、磷钼酸、磷钨酸、苯胺蓝等主要染色试剂，还可能包括其他辅助试剂，如冰醋酸、分化液等。    - **其他试剂**：如乙醇（用于脱水）、二甲苯（用于透明）、蒸馏水等。 2. 设备    - **切片机**：用于制作石蜡切片或冰冻切片。    - **染色缸**：盛放各种染色试剂，方便组织切片在不同试剂中浸泡染色。    - **显微镜**：用于观察染色后的组织切片，评估染色效果和组织结构。    - **载玻片和盖玻片**：用于承载组织切片和封片。 **三、实验步骤** 1. 石蜡切片染色步骤    - **脱蜡至水**：        - 将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ中浸泡10 - 15分钟，使石蜡溶解，更换二甲苯Ⅱ，再浸泡10 - 15分钟。        - 然后依次放入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各浸泡5分钟左右，最后用蒸馏水冲洗切片，使切片从有机相过渡到水相。    - **染液染色**：        - 将切片放入Weigert铁苏木精染液中染色5 - 10分钟，使细胞核染成黑色。        - 用流水冲洗切片，然后放入酸性复红溶液中染色5 - 10分钟，使细胞质和肌纤维染成红色。    - **分化**：        - 将切片放入磷钼酸 - 磷钨酸溶液中浸泡10 - 15分钟进行分化，使肌纤维颜色更加鲜明，同时去除细胞质中多余的红色染料。    - **苯胺蓝染色**：        - 直接将切片放入苯胺蓝溶液中染色5 - 10分钟，使胶原纤维染成蓝色。    - **脱水、透明和封片**：        - 染色后，将切片依次放入95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ各浸泡5分钟左右进行脱水。        - 然后放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡5 - 10分钟进行透明。        - 最后在切片上滴加适量中性树胶，盖上盖玻片，用镊子轻轻按压，使盖玻片与切片贴合紧密，避免产生气泡。 2. 冰冻切片染色步骤    - **固定**：        - 新鲜的冰冻切片从冰箱中取出后，立即放入固定液（如4%多聚甲醛）中固定10 - 15分钟，使组织细胞的形态和结构固定。    - **水洗**：        - 用蒸馏水冲洗切片3 - 5次，每次3 - 5分钟，去除固定液。    - **染液染色、分化和苯胺蓝染色**：        - 步骤与石蜡切片基本相同，但由于冰冻切片没有经过石蜡包埋等处理，组织结构相对脆弱，在操作过程中要更加小心，避免切片损坏。    - **脱水、透明和封片**：        - 因为冰冻切片较薄，脱水和透明时间可以适当缩短。通常在70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各浸泡3 - 5分钟，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡3 - 5分钟，然后进行封片。 **四、结果观察与分析** 1. 细胞核    - 经过Weigert铁苏木精染液染色后，细胞核呈现黑色。可以观察细胞核的大小、形状、位置以及核内结构（如核仁），这有助于判断细胞的类型和状态。 2. 肌纤维    - 被酸性复红染色后呈红色，通过观察肌纤维的分布、走向和形态，可以了解肌肉组织的结构和功能。例如，在心肌组织中，心肌纤维呈分支状，相互连接成网状；在平滑肌组织中，肌纤维呈长梭形，排列较为规则。 3. 胶原纤维    - 被苯胺蓝染色后呈蓝色。可以观察胶原纤维在组织中的分布和含量，这对于研究组织的纤维化程度、创伤修复等过程具有重要意义。例如，在肝脏纤维化的组织中，会出现大量蓝色的胶原纤维增生。 **五、注意事项** 1. 试剂质量和配制    - 染色试剂的质量直接影响染色效果。购买高质量的染色试剂盒，并按照说明书正确配制和保存试剂。例如，Weigert铁苏木精染液需要提前配制并放置一段时间使其成熟后才能使用；苯胺蓝溶液的pH值可能需要根据实际情况进行调整，以获得最佳染色效果。 2. 染色时间和温度    - 染色时间和温度是影响染色效果的关键因素。不同的组织类型、切片厚度和染色试剂的批次等都会导致最佳染色时间的差异。一般在常温下染色，但如果温度较低，染色时间可能需要适当延长。同时，在染色过程中要注意避免切片干燥，以免影响染色效果。 3. 操作过程中的细节    - 在脱蜡、脱水、透明等过程中，要确保试剂的更换及时、彻底。如果脱蜡不彻底，会影响后续的染色；如果脱水不完全，在透明和封片过程中可能会出现云雾状的模糊区域。在封片时，要注意避免产生气泡，气泡会影响观察效果。