体外抗菌性能测试是评估材料、药物或其他物质抑制或杀灭细菌能力的重要实验方法，主要用于抗菌剂的研发、医疗器械的抗菌性能评价等诸多领域。以下是详细介绍： **一、测试方法分类及原理** 1. 琼脂扩散法   - 原理：将含有一定量细菌的琼脂培养基作为细菌生长的载体，把测试样品（如抗菌药物纸片、涂有抗菌材料的载体等）放置在琼脂表面。在培养过程中，抗菌物质会从样品中扩散到周围的琼脂中，形成一个浓度梯度。如果样品具有抗菌性能，在其周围会形成一个细菌生长受抑制的区域，即抑菌圈。抑菌圈的大小与抗菌物质的抗菌活性和扩散能力有关。   - 操作：     - 制备细菌悬液，将测试细菌接种于合适的液体培养基中，在适宜的温度下培养一定时间，使其达到一定的生长浓度（如麦氏浊度为0.5）。     - 将细菌悬液均匀涂布在琼脂平板上，待琼脂表面干燥后，放置测试样品。对于纸片扩散法，使用含有一定量抗菌药物的纸片；对于材料测试，将抗菌材料制成一定大小的薄片或圆片放在琼脂表面。     - 将平板置于适宜的温度下培养一定时间（如18 - 24小时），观察并测量抑菌圈的大小。 2. 肉汤稀释法   - 原理：将抗菌物质与细菌在液体培养基中混合，通过系列稀释抗菌物质的浓度，观察细菌在不同浓度下的生长情况。可以测定抗菌物质的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。MIC是指能够抑制细菌可见生长的最低抗菌物质浓度，MBC是指能够杀灭99.9%细菌的最低抗菌物质浓度。   - 操作：     - 制备系列浓度的抗菌物质溶液，通常采用二倍稀释法，即在一系列试管或微孔板的孔中，依次加入成倍稀释的抗菌物质溶液。     - 向每个含有抗菌物质溶液的试管或孔中加入等量的细菌悬液，使细菌的最终浓度达到一定标准（如10⁵ - 10⁶CFU/mL）。     - 将这些试管或微孔板在适宜的温度下培养一定时间（如18 - 24小时），观察细菌生长情况。通过观察细菌生长导致的培养基浑浊度变化或采用其他检测方法（如比浊法、分光光度法）来判断细菌是否生长。确定MIC后，从无细菌生长的孔中取少量培养物接种到不含抗菌物质的新鲜培养基中，继续培养，观察细菌是否重新生长，以确定MBC。 3. 时间 - 杀菌曲线法   - 原理：在固定的抗菌物质浓度下，观察细菌数量随时间的变化情况，能够直观地反映抗菌物质的杀菌动力学。可以了解抗菌物质是快速杀菌还是抑菌后缓慢杀菌等杀菌模式。   - 操作：     - 将细菌悬液与一定浓度的抗菌物质溶液混合，使细菌和抗菌物质的初始浓度达到预定值。     - 在不同时间点（如0、1、2、4、6、8小时等）取样，采用合适的方法（如平板计数法）测定细菌数量。平板计数法是将取样后的菌液进行系列稀释，然后取一定量的稀释液涂布在琼脂平板上，培养后计数菌落形成单位（CFU）。     - 根据不同时间点的细菌数量绘制时间 - 杀菌曲线，以时间为横坐标，细菌数量的对数为纵坐标。 **二、测试细菌的选择及培养条件** 1. 测试细菌的选择   - 标准菌株：通常会选用具有代表性的标准菌株，这些菌株的生物学特性和药敏特性明确，便于比较不同测试结果。例如，在革兰氏阳性菌中常用金黄色葡萄球菌（ATCC 25923），革兰氏阴性菌中常用大肠杆菌（ATCC 25922）。   - 临床分离菌株：对于抗菌药物的临床评价或研究与临床相关的抗菌材料，会使用从临床样本（如痰液、血液、尿液等）中分离得到的细菌菌株。这些菌株能够更好地反映实际临床环境中的细菌对抗菌物质的反应。   - 耐药菌株：随着细菌耐药性问题的日益严重，测试中也会选用耐药菌株来评估抗菌物质对耐药菌的抗菌性能。例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）用于测试新型抗菌药物或材料对耐药菌的抑制能力。 2. 培养条件   - 培养基：根据测试细菌的种类选择合适的培养基。例如，大多数细菌可以在普通营养琼脂或肉汤培养基中生长，但有些细菌可能需要特殊的培养基。如李斯特菌需要在含有李斯特菌增菌肉汤（LB）的培养基中生长。   - 温度和气体环境：不同的细菌有其适宜的生长温度和气体环境。例如，大多数病原菌在37℃下生长良好，而一些环境细菌可能在25℃或其他温度下生长更好。有些细菌是需氧菌，需要充足的氧气；有些是厌氧菌，需要在无氧环境下生长；还有些是兼性厌氧菌，在有氧和无氧环境下都能生长。 **三、影响测试结果的因素及质量控制措施** 1. 影响因素   - 抗菌物质的物理化学性质：如抗菌物质的溶解性、稳定性等会影响其在测试体系中的分布和活性。例如，如果抗菌药物在培养基中溶解性差，可能无法充分发挥其抗菌作用，导致测试结果偏低。   - 细菌的生长状态：细菌的生长阶段（如对数期、稳定期）、初始接种量等都会影响测试结果。处于对数期的细菌生长活跃，对抗菌物质的反应可能更敏感；接种量过高或过低都可能影响对MIC和MBC的准确判断。   - 测试环境：包括温度、湿度、pH等。例如，pH的变化可能影响抗菌物质的活性和细菌的生长，一些抗菌药物在酸性环境下活性增强，而另一些可能在碱性环境下更有效。 2. 质量控制措施   - 阳性和阴性对照：在每次测试中都要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照使用已知有效的抗菌物质，用于验证测试体系的有效性；阴性对照使用不含抗菌物质的空白样品，用于检查是否有非特异性的细菌抑制因素（如培养基的质量问题）。   - 标准操作程序：严格按照标准操作程序进行实验，包括细菌培养、抗菌物质的配制和稀释、样品的制备和放置、结果的观察和记录等环节，确保实验的一致性和可重复性。   - 仪器设备的校准：定期对实验中使用的仪器设备（如分光光度计、培养箱等）进行校准，保证测量的准确性。例如，培养箱的温度要准确控制在设定范围内，分光光度计的波长准确性和吸光度准确性要符合要求。