蛋白质和多肽的分子量与分布是其重要的特性参数，对于理解其结构、功能以及在生物体内的作用具有重要意义。

一、分子量的测定方法

1. 凝胶过滤色谱法（Gel Filtration Chromatography，GFC）

• 原理：根据分子大小进行分离。蛋白质或多肽在凝胶过滤介质中，小分子物质进入凝胶颗粒内部，而大分子则在凝胶颗粒外部流动，从而实现分离。

• 操作：将样品注入色谱柱，用适当的缓冲液进行洗脱，通过检测洗脱液中的蛋白质或多肽浓度，得到洗脱曲线。

• 结果分析：根据洗脱体积与已知分子量标准品的关系，可以估算样品的分子量。同时，还可以得到分子量分布的信息。

2. 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

• 原理：SDS 能使蛋白质变性并与蛋白质结合，使蛋白质带上大量负电荷，消除蛋白质的电荷和形状差异，仅根据分子量进行分离。

• 操作：将蛋白质或多肽样品与 SDS 和还原剂混合后，进行电泳。电泳结束后，通过染色使蛋白质可视化，根据蛋白质的迁移距离与已知分子量标准品的关系，确定样品的分子量。

• 结果分析：可以得到蛋白质或多肽的近似分子量。但对于分子量较大或较小的样品，可能存在误差。

3. 质谱法（Mass Spectrometry，MS）

• 原理：通过测量离子的质荷比来确定分子量。蛋白质或多肽样品在离子源中被电离，形成离子，然后进入质量分析器进行分析。

• 操作：将样品进行适当的处理后，注入质谱仪。可以采用不同的电离方式，如电喷雾电离（ESI）、基质辅助激光解吸电离（MALDI）等。

• 结果分析：可以得到非常准确的分子量信息，并且可以同时分析多个蛋白质或多肽的分子量。此外，质谱还可以提供蛋白质或多肽的序列信息，有助于进一步研究其结构和功能。

二、分子量分布的测定方法

1. 凝胶过滤色谱法（GFC）

• 如前所述，GFC 不仅可以测定分子量，还可以得到分子量分布的信息。通过分析洗脱曲线的形状，可以了解样品中不同分子量组分的相对含量。

2. 多角度激光散射法（Multi-Angle Laser Light Scattering，MALLS）

• 原理：当激光照射到溶液中的分子时，会发生散射。通过测量不同角度的散射光强度，可以计算出分子的分子量和尺寸分布。

• 操作：将蛋白质或多肽样品与激光散射仪连接，进行测量。通常与其他分离技术（如 GFC 或 HPLC）结合使用，以提高测量的准确性。

• 结果分析：可以得到准确的分子量分布信息，并且不受样品浓度和形状的影响。

3. 动态光散射法（Dynamic Light Scattering，DLS）

• 原理：通过测量溶液中分子的布朗运动引起的散射光强度的波动，来计算分子的尺寸分布。

• 操作：将蛋白质或多肽样品置于合适的缓冲液中，放入动态光散射仪的样品池中，仪器发射激光并检测散射光强度的变化，通过相关函数的计算来分析分子的大小及其分布情况。

• 结果分析：可以快速得到样品中分子的流体动力学半径分布，从而推断分子量分布的大致情况。不过这种方法对于存在聚集体或者形状不规则的分子可能会有一定误差，且得到的是相对分子量的分布范围，不如质谱等方法精确。 **三、影响因素及应用场景** 1. 影响因素   - 蛋白质和多肽的结构：包括一级结构（氨基酸序列）、二级结构（如α - 螺旋、β - 折叠）和三级结构（整体空间构象）。结构复杂的蛋白质，其在测定过程中的行为可能会受到空间位阻等因素的影响，从而影响分子量及分布的测定结果。   - 修饰情况：如糖基化、磷酸化等修饰会增加蛋白质的分子量。并且修饰程度的不同也会导致分子量分布变宽，例如糖蛋白的糖基化程度不同，其分子量会在一定范围内变化。   - 样品的纯度：杂质的存在会干扰分子量及分布的测定。例如，在凝胶过滤色谱中，杂质可能与目标蛋白质或多肽一起洗脱，导致洗脱峰变宽，影响分子量分布的判断。 2. 应用场景   - 生物制药领域：在蛋白质药物的研发和生产过程中，准确测定分子量和分布至关重要。这有助于确保药物的质量、稳定性和疗效。例如，单克隆抗体药物的分子量及分布需要严格控制，以保证其安全性和有效性。   - 蛋白质组学研究：了解细胞或组织中蛋白质和多肽的分子量及分布，有助于发现新的蛋白质、研究蛋白质的表达调控以及蛋白质之间的相互作用。比如通过比较正常细胞和病变细胞中蛋白质分子量分布的差异，来寻找疾病相关的生物标志物。   - 食品科学：对于食品中的蛋白质成分，如乳清蛋白、大豆蛋白等，分子量及分布的研究可以帮助评估食品的营养价值、加工质量和稳定性。例如，在乳制品加工过程中，监测乳清蛋白分子量的变化可以优化加工工艺，保证产品质量。