MTT/CCK - 8细胞毒性实验是两种常用的用于评估化合物、药物或其他因素对细胞毒性的体外实验方法。以下是详细介绍： **一、MTT实验** 1. 原理   - MTT（3 - (4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基) - 2,5 - 二苯基四氮唑溴盐）是一种黄色的水溶性染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将MTT还原为不溶于水的蓝紫色甲瓒（Formazan）结晶，而死细胞则无此功能。通过溶解甲瓒结晶后用酶标仪检测其在特定波长下的吸光度，吸光度值与活细胞数量成正比，从而可以反映细胞的存活状态和细胞毒性情况。 2. 实验步骤   - 细胞培养与铺板：     - 首先将细胞培养在合适的培养基中，在适宜的温度（通常为37℃）和二氧化碳浓度（5%）下培养，使其处于对数生长期。     - 然后将细胞用胰蛋白酶消化后，按照一定的细胞密度（如每孔1×10⁴ - 1×10⁵个细胞）接种到96孔板中，每孔加入100 - 200μL的细胞悬液，继续培养一段时间（如24小时），让细胞贴壁并稳定生长。   - 药物处理：     - 配制不同浓度的测试药物溶液，通常采用倍比稀释法，如设置一系列浓度梯度，从高浓度到低浓度（例如1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL等）。     - 小心吸出96孔板中原有的培养基，然后加入含有不同浓度药物的新鲜培养基，每个浓度设置3 - 6个复孔，同时设置阴性对照（只加培养基，不含药物）和空白对照（不加细胞，只加培养基和MTT）。将96孔板放入培养箱中继续培养一定时间（如24 - 72小时），具体时间根据实验需求和细胞类型而定。   - MTT处理：     - 在培养结束后，每孔加入MTT溶液（一般浓度为0.5 - 1mg/mL），每孔10 - 20μL，然后将96孔板放回培养箱中继续孵育3 - 4小时，使活细胞充分将MTT还原为甲瓒。   - 溶解甲瓒：     - 小心吸出孔内液体，注意不要吸出甲瓒结晶。然后每孔加入100 - 200μL的DMSO（二甲基亚砜）等有机溶剂来溶解甲瓒结晶，将96孔板放在摇床上低速振荡10 - 15分钟，使结晶完全溶解。   - 检测吸光度：     - 使用酶标仪在490 - 570nm波长处（通常为570nm）检测各孔的吸光度值。 3. 结果分析   - 计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（实验组吸光度 - 空白组吸光度）/（对照组吸光度 - 空白组吸光度）×100%。根据计算得到的细胞存活率，绘制细胞存活率 - 药物浓度曲线，以直观地观察药物浓度与细胞毒性之间的关系。通过曲线可以确定药物的半数抑制浓度（IC₅₀），即细胞存活率为50%时对应的药物浓度，IC₅₀是评估药物细胞毒性的一个重要指标。 **二、CCK - 8实验** 1. 原理   - CCK - 8（Cell Counting Kit - 8）试剂的主要成分是一种水溶性的四唑盐（WST - 8）。在电子耦合试剂存在的情况下，活细胞中的脱氢酶可以将WST - 8还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臜产物，其颜色深浅与活细胞数量呈线性关系。通过酶标仪检测其在450nm波长处的吸光度，可以反映细胞的活性和增殖情况，从而评估细胞毒性。 2. 实验步骤   - 细胞培养与铺板：与MTT实验类似，将处于对数生长期的细胞消化后，按照合适的细胞密度接种到96孔板中，培养一段时间让细胞贴壁生长。   - 药物处理：配制不同浓度的测试药物溶液，按照与MTT实验相同的方式加入含有不同浓度药物的培养基到96孔板中，设置对照孔，然后在培养箱中培养一定时间。   - CCK - 8处理：在培养结束后，每孔加入10 - 20μL的CCK - 8溶液，将96孔板放回培养箱中继续孵育1 - 4小时（具体时间可根据细胞类型和药物作用情况调整），使细胞与CCK - 8充分反应。   - 检测吸光度：直接使用酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度值，同时可以在600 - 650nm波长处设置一个参比波长，以减少背景干扰。 3. 结果分析   - 计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。同样，根据细胞存活率绘制细胞存活率 - 药物浓度曲线，确定IC₅₀等指标来评估细胞毒性。与MTT实验相比，CCK - 8实验的结果更稳定，因为其产物是水溶性的，不需要有机溶剂溶解，减少了对实验结果的干扰因素。 **三、MTT/CCK - 8实验的应用和注意事项** 1. 应用   - 药物研发：在药物筛选过程中，用于评估新化合物对细胞的毒性，初步筛选出具有较低细胞毒性的潜在药物。同时，也可以用于研究药物的剂量 - 反应关系，为药物的临床试验提供参考。   - 细胞毒性研究：研究环境污染物、化学物质、纳米材料等对细胞的毒性作用。例如，评估化妆品成分、食品添加剂、工业化学品等对细胞的安全性。   - 细胞生理研究：通过比较不同细胞系或在不同培养条件下细胞的活性，研究细胞的生理特性和生长规律。 2. 注意事项   - 细胞状态：实验所用细胞应处于良好的生长状态，避免使用老化或受污染的细胞。在细胞接种时，要确保细胞均匀分布在孔板中，否则会影响吸光度的测量和结果分析。   - 药物溶解性和稳定性：对于测试药物，要注意其在培养基中的溶解性和稳定性。如果药物溶解性差，可能会影响其与细胞的接触和作用效果；药物在培养过程中不稳定可能会导致实验结果不准确。   - 实验操作时间：MTT和CCK - 8实验都有严格的时间要求，如MTT孵育后甲瓒结晶的溶解时间、CCK - 8与细胞反应的时间等。如果时间控制不当，会影响吸光度的测量和结果的准确性。   - 对照设置：正确设置阴性对照、阳性对照和空白对照对于结果的准确分析非常重要。阴性对照可以反映正常细胞的生长情况，空白对照可以用于扣除背景吸光度，阳性对照（如果有，如已知的细胞毒性药物）可以用于验证实验方法的有效性。